高通量蛋白質穩(wěn)定性分析中的差示掃描熒光法(Differential Scanning Fluorimetry，DSF)是一種基于蛋白質熱變性過程的熒光檢測方法。
蛋白質穩(wěn)定性
蛋白質穩(wěn)定性是生物技術藥物重要的關鍵質量屬性之一，它決定了生物藥物的藥效、生產可行性、安全性及保質期。蛋白質高級結構穩(wěn)定性確保了蛋白質在其貨架壽命期內保持活性和安全。
穩(wěn)定性研究被用來確認蛋白質在不同條件下高級結構HOS(High Order Structure)的穩(wěn)定性，如溫度、pH值、輔料成分及儲存時間等，以確定適宜的存儲和運輸條件。同時，監(jiān)管機構如FDA、EMA等在授權生物藥使用批準之前也要求廣泛的穩(wěn)定性數據。因此，理解和確保治療性蛋白質藥物的高級結構穩(wěn)定性是生物制藥企業(yè)開發(fā)安全有效藥物的必要條件，研究人員需要在研發(fā)和生產的多個階段對蛋白質高級結構穩(wěn)定性進行分析和評估。
蛋白質穩(wěn)定性的常見分析方法
蛋白質的穩(wěn)定性分析通常會使用以下方法進行研究：
生化方法
圓二色譜(CD，Circular Dichroism Spectroscopy)
差示掃描量熱法(DSC)
定量PCR(qPCR)技術(外源熒光DSF)
動態(tài)光散射(DLS)與靜態(tài)光散射(SLS)方法
差示掃描量熱法(DSC)法常常被做為蛋白質穩(wěn)定性分析最重要的的解決方案，然而，由于對儲存于微孔板(如96或384孔板)上的大量樣品的快速分析需求，使得DSC在藥物篩選和早期開發(fā)中的應用受到一定的限制。因此，DSF(內源熒光法)已成為一種流行且具有成本效益的解決方案。
DSF(內源熒光法)無需對待測樣品進行任何標記，也無需使用任何熒光探針，即可快速測量整塊樣品微孔板，并提供高通量數據以幫助樣品候選物和配方成分的篩選。
DSF法快速篩選大量樣品，大大提高了藥物篩選、成藥性分析的效率，分析結果與DSC技術互相正交驗證。對很多生物技術藥物而言，利用DSF方法做為快速大量篩選，使用DSC技術來正交驗證DSF的早篩結果，是藥物篩選和藥物開發(fā)的一個有效方案。
DSF在蛋白質穩(wěn)定性分析領域具有廣泛的應用，包括但不限于以下幾個方面：
蛋白質熱穩(wěn)定性檢測：大多數蛋白質對溫度具有嚴格的要求，蛋白熱穩(wěn)定性的評估有助于蛋白功能的正常表達。DSF不僅可以高通量測定蛋白質的熱穩(wěn)定參數，而且還能評估突變、pH、離子強度等因素對熱穩(wěn)定性的影響，并從中篩選出可以提高熱穩(wěn)定性的因素。
蛋白質穩(wěn)定劑、抑制劑的高通量篩選：通過對化合物配體庫進行高通量篩選，獲得與蛋白樣品相結合的候選化合物，評估化合物對蛋白穩(wěn)定性的影響，從而篩選出蛋白質穩(wěn)定劑、抑制劑、輔助因子及分子伴侶。
蛋白質作用機制研究：如蛋白-蛋白互作研究，新發(fā)現蛋白藥物的親和動力學分析，蛋白與配體、輔助因子、分子伴侶結合的熱穩(wěn)定性參數測試。
小分子化合物抑制機制研究：利用DSF可以進行高通量、矩陣式的多種化合物檢測(化合物與一些已知的抑制劑、底物、產物或輔助因子等結合)，用于小分子化合物抑制劑的篩選及其藥理機制的研究。
蛋白質結構研究：蛋白質結晶是研究蛋白質結構的一個非常重要的手段，利用DSF可以高通量篩選蛋白質的結晶條件。
DSF技術原理：
差示掃描熒光法(DSF)是一種經濟高效且易于使用的生物物理技術，它通過檢測當溫度升高或變性劑存在時熒光發(fā)射光譜的相應變化來確定蛋白質的變性轉變溫度(熱轉變溫度Tm值或化學變性Cm值)。
研究發(fā)現，蛋白質分子中芳香環(huán)氨基酸在處于不同極性的微環(huán)境時(如疏水或親水環(huán)境中)，其被激發(fā)的內源熒光的最大發(fā)射光譜會發(fā)生位移。蛋白質中內源熒光主要來自含芳香環(huán)氨基酸如色氨酸(Trp)，苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)，其中以色氨酸內源熒光強。
以色氨酸為例，在蛋白質疏水的內核微環(huán)境中，其內源熒光最大發(fā)射波長在330nm左右，而在親水的極性微環(huán)境中，色氨酸的內源熒光最大發(fā)射波長則出現在350nm左右。蛋白質熱變性或者化學變性通常會導致色氨酸殘基周圍微環(huán)境的極性發(fā)生變化，使通常被包埋于蛋白質疏水內核的色氨酸逐漸暴露于親水的環(huán)境中，從而導致內源熒光最大發(fā)射波長發(fā)生紅移(Red Shift)，即向更大的波長區(qū)域移動。
這種監(jiān)測色氨酸內源熒光變化的方法無需熒光探針或者標簽，避免了傳統(tǒng)外源熒光DSF中背景熒光以及非特異吸附等假陽性結果。
當蛋白質由于熱變性或者化學變性劑(如鹽酸胍、尿素等)作用而發(fā)生去折疊時，測量內源熒光隨溫度或者變性劑的變化來就可以研究蛋白質的展開過程。這些變化的數據可以用于生成熔解曲線，并獲取表觀熱轉變溫度Tm值、Tonset、范德華焓變(ΔH)、吉布斯自由能(ΔG)、化學變性Cm值等用于蛋白質穩(wěn)定性的評估和預測。
傳統(tǒng)DSF經常使用350/330比值法來進行數據分析，而SUPR-DSF提供了多種分析方法，除了比值法外，SUPR-DSF還提供了BCM(Barycentric mean,質心均值法)，可以得到比350/330比值法更好的信噪比，同時更有利于低濃度蛋白樣品的分析。
高通量蛋白質穩(wěn)定性分析DSF系統(tǒng)主要特點：
采用標準的384微孔板，無需特殊的耗材和毛細管
高通量篩選，一個升溫過程(60-80分鐘)內可完成
單塊384微孔板的測試利用內源熒光，無需染料或標簽，兼容常用生物體系UV LED激發(fā)配合全光譜檢測
僅需要10-30μl樣品，樣品濃度0.05~250mg/mL
獲得關鍵參數：Tonset、Tm、ΔΗ、ΔG、Cm及親和力等
提供嚴謹的數據質量和可重復性
SUPR-DSF系統(tǒng)的應用：
SUPR-DSF系統(tǒng)廣泛應用于生命科學基礎研究和藥物研發(fā)等多個領域：
加速突變體的篩選
配方和預配方的篩選和優(yōu)化
蛋白結晶條件篩選
批間一致性評估
生物相似性評估
加速應力和強制降解研究
結合誘導的構象變化分析
翻譯后修飾評估
恒溫和化學穩(wěn)定性分析
高通量蛋白質穩(wěn)定性分析DSF系統(tǒng)的技術規(guī)格：
典型應用案例--加速突變體的篩選
使用SUPR-DSF對16個樣品進行比較和篩選，其中包括1個野生型蛋白(WT)和15個單點突變體。在1.5小時內，DSF儀器生成了48個樣本(每組3次重復)的高質量熔解曲線(相同時間內最多可生成384孔的數據)。用模型對數據進行擬合，可獲取熔解溫度Tm值并對穩(wěn)定性進行排序和篩選。
如圖1所示，與WT(藍色)相比，其中3個突變體(9、13和14)的熔解曲線左移，說明其蛋白穩(wěn)定性降低；余下12個突變體的穩(wěn)定性均有所提高。其中，突變體1、8和12的穩(wěn)定性提升最大。
圖2展示了幾個代表性樣本的熔解曲線，可以發(fā)現一些蛋白質發(fā)生了單一熱轉變過程(WT蛋白與突變體7和8)，而另一些蛋白質(突變體1和14)則清楚地顯示出兩段熱轉變過程，即熔解曲線上有兩個拐點。通過SUPR-DSF提供的數據，可以幫助研究者篩選出有前景的候選物進行深入研究。
精確解析單抗的Fab區(qū)域
使用SUPR-DSF獲得NISTmAb(NIST單抗標準品)的差示掃描熒光數據，并將結果與差示掃描量熱法(DSC)所獲得的數據進行比較。SUPR-DSF可以解析NISTmAb所有的三個結構域:CH2(69°C)，CH3(83°C)，和Fab區(qū)域(94°C)。SUPR-DSF的最高掃描溫度為105°C，可以精確測量異常穩(wěn)定的Fab區(qū)域熔解溫度，而其他DSF平臺的掃描最高溫度一般僅為95°C，容易丟失單抗Fab區(qū)域去折疊變性的重要信息(圖5(a))。
將SUPR-DSF歸一化后的數據與DSC結果進行比較。如圖5(b)所示，三個峰相互匹配，證明了兩種技術良好的一致性，使用SUPR-DSF可以輕松獲得高質量的蛋白質穩(wěn)定性信息。
典型應用案例--加速曲妥珠單抗的輔料和配方篩選
生物治療藥物如抗體等的配方是保證藥效、生產可行性和安全性的基礎，也決定了儲存和運輸的條件。制藥企業(yè)亟需高通量的方法來快速可靠地篩選大量的條件組合，以確定最佳配方。
使用SUPR-DSF，研究者對治療性抗體曲妥珠單抗在96種不同條件下的穩(wěn)定性進行了篩選和分析，并在1.5小時內完成了測試。測試結果與差示掃描量熱法(DSC)的結果非常一致。如果集成實驗室自動化設備，每天可以完成數千個樣品的篩選。
DSF熔解曲線顯示出兩個獨立的轉變區(qū)域，通過最小二乘法對數據進行擬合，可以確定Tonset值、Tm值和范德華焓變(△H)。圖3(a,b)分別展示了破壞/增強穩(wěn)定性的輔料的熔解曲線及擬合圖。圖4(a)列出了能夠提高抗體穩(wěn)定性的所有輔料(與對照樣品相比)。
SUPR-DSF正確鑒別了已上市的曲妥珠單抗中使用的輔料組氨酸和海藻糖的穩(wěn)定性作用，如圖4(b)所示，SUPRDSF數據具有出色的可靠性和一致性，同時提供驚人的高通量。
利用高通量差示掃描熒光法獲得結合參數
結合分析研究是藥物研發(fā)的一個關鍵領域，相互作用的特征和KD值(解離平衡常數，表征分子間結合的親和力)對候選物的選擇是至關重要的，研究者需要采用多種原理互補的方法來篩選和確定文庫中的數千種至數萬種小分子化合物。
通過SUPR-DSF進行分子相互作用分析，不受表面效應、物質遷移(mass transport)或緩沖液折光率問題等因素的影響，可在分析物結合濃度范圍內提供高通量、無需標記的測量。
通過檢測蛋白質-配體復合物的穩(wěn)定性變化，可用于確認結合的特異性；通過熱變性時熒光發(fā)射光譜的變化和配體濃度的函數關系可以計算KD值。即使對于非常弱的結合分子，結合所誘導的穩(wěn)定性變化也能被SUPR-DSF檢測到。
使用標準384微孔板，能夠在一天內篩選數千個樣品的穩(wěn)定性，從而確認結合狀態(tài)。
使用SUPR-DSF研究配體(TFMSA)與人碳酸酐酶I的結合作用，碳酸酐酶隨TFMSA濃度變化的熔解曲線如圖6所示。
圖7顯示了人碳酸酐酶I的Tm值與TFMSA濃度的關系，擬合所獲得的KD值有兩個，分別為2.1μM和174.2μM，與
文獻中的數值一致，證明SUPR-DSF可以用作配體結合研究的預篩選或確認工具，并且具有靈敏度。
直觀簡明的軟件
SUPR-DSF軟件提供直觀、簡潔、智能、高效的實驗設計與數據分析功能，既可以讓初學者快速上手，又可為經驗豐富的資深用戶提供多種進階選項。
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